[성향저격 분자진단] PCR, 넌 어디까지 알고 있니?(바이오마이크로시스템연구단 김미연 기자)(하나7.하나하나.2하나) 정보

PCR, 넌 어디까지 알아? PCR(polymer chain reaction)은 원하는 DNA의 sequence를 통해 다량의 DNA를 증폭하는 기술입니다. Denaturation, Annealing, Extension의 3단계로 구성됐으며 이 과정이 반복되면서 DNA가 증폭된다. 기본적으로 DNA template, primer, dNTP, polymerase 등으로 구성되어 진행된다. 김 1은 유전자를 증폭시키는 PCR의 여러 종류를 파헤치고자 합니다. 1)RT-PCR(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction)

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특정 부위의 RNA를 template라고 하고 그에 상응하는 cDNA(complementary DNA)를 합성한 다소비, PCR 증폭을 하는 기술입니다. 실험 과정은 한가지 역전사 효소(reverse transcriptase)을 이용하고 RNA에서 cDNA을 제조하는 과정과 2)cDNA을 이용하여 특정 부위를 증폭시키는 과정에서 나쁘지 않아서 재우고 2)과정은 genomic DNA에서 특정 유전자를 증폭시키는 비결 같다. 이 비법은 노던블롯 혼성화 분석(Northernblothybridization)과 같은 비법을 사용하는 RNA 분석보다 실험 비법이 간단할 뿐만 아니라 유전자의 염기서열 표결이 가능하기 때문에 주로 mRNA의 염기서열 및 전사량을 연구할 때 큰 도움이 된다. 염기서열이 알려진 유전자의 경우 RT-PCR를 통해 전장의 cDNA를 쉽게 합성해 복제(cloning)할 수도 있다. 2)Allele-specific PCR DNA상에서 하 나쁘지 않아의 욤키망 다른 SNP(single-nucleotide polymorphisms, 단 1욤키쵸은쵸은)을 분석하는 기술로서 서로 다른 allele의 DNA sequence만이라면 primer를 제작하고 allele-specific PCR을 할 수 있다. Allele-specific PCR은 template와 SNP-specific primer사이에 불 1촌 mismatch)의 존재를 확신하게 판단하고 기존의 PCR에서 비특이적 증폭(amplification)을 막아 성공적으로 원하는 template만 증폭시킬 수 있다.

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3)Asymmetric PCR Asymmetric PCR은 비대칭, 불균형의 의미를 갖고 Asymmetric이라는 단어에서 보듯 두 가닥의 DNA단일의 DNA만을 증폭시키는 데 사용하는 기술이었다 Single strand만을 얻을 목적으로 쓰였으며, Primer두개를 사용한다. 두 primer의 농도를 100:1로 섞어 PCR을 갖고 PCR초기 단계에서 한쪽의 primer는 소비해서 과잉 primer에 single strand DNA가 발생했다.

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4)RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)

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cDNA을 복제(cloning) 하려면 cDNA library를 검사(screening) 만드는 비결이 가장 1반 적이지만 이 비결과 조 썰매 타고 screening을 하고 발견한 clone은 대개 모드 cDNA의 1부이며 계속 반복해서 screening을 하면 왕모도우 cDNA을 얻을 수 있다. 반복 작업이 필요한 만큼 상당한 시간과 노력을 소모하는 작업이며 유전자 자체가 cDNA library에 적은 양으로 존재할 경우에는 더욱 힘든 작업이 되어버린다. 이 문제를 해결하고자, 1988년 Frohmann등은 RACE(rapid amplification of cDNA ends)PCR기술을 만들어 냈다. cDNA의 1부 염기 서열만 알고 있으면 이 부분에서 gene specific primer를 합성하고 PCR반응(reaction)을 통해서 5'-end혹은 3'-end까지 DNA을 증폭하는 것이었다 3'-RACE PCR의 비결은 모든 mRNA 3'-end에 존재하는 poly(A)tail(AAAAAAAA...AAAA-3')을 이용 해서 그와 대응된 oligo-(dT)primer(5'-TTTTTT...TTT-3')을 반응시켜서 cDNA을 합성시킬 수 있다. 5)IS-PCR(In Situ Polymerase Chain Reaction)

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PCR은 원하는 DNA를 대량으로 증폭시키는 노하우이며, in situhybidization(ISH)은 세포나 조직에 존재하는 극미량의 DNA나 RNA를 찾을 수 있는 소리는 물론 원하는 유전자의 위치까지 확인할 수 있는 노하우였다. ISPCR은 이 2가지 비법의 장점을 조합하고 응용한 노하우로 PCR의 민감성(sensitivity)와 ISH의 특정성(specificity)양쪽을 겸비하고 있다. IS-PCR의 점검원리는 초반적인 PCR 노하우와 동일하나 슬라이드 글라스 등의 사용에 적합한 IS-PCR용 기구가 필요하며 사용하는 기구에 따라 반응시키는 노하우가 다양하게 제시되어 있다.  IS-PCR는 세포내의 target sequence를 증폭시킴으로써 반응이 시작되며 세포막을 통해 다양한 물질이 이동하기 쉽도록 세포막을 HCl(염화수소, 강산), proteinase K(단백질분해효소) 등으로 처리하는 과정을 거쳐야 합니다. 이 과정에 이상이 생기면 세포가 손상되거나 파괴될 수 있으므로 적절한 선택과 사용이 중요하다. 현재로서는 IS-PCR 노하우의 효율이 기대 효과만큼 높지는 않지만 민감성과 특정성이 높아야 하는 진단 및 분석 분야에서는 유용하게 쓰일 것으로 기대된다.  6)Hot start PCR Taq하나 polymerase효소는 37℃에서도 효소 활성이 좋아 가끔 첫 denaturation과정이 완전히 진행되기 전에 primer가 DNA분자에 붙어 증폭(extension) 되는 경우가 있다. 이처럼 아침에는 온도에서 결합(annealing)이 처음일 경우 primer의 불초값 접합 확률이 높아 결과적으로 정밀도가 떨어지는 결과를 낳는다. 이를 저지하는 노하우가 Hot-start PCR기술이었다 Hot-start PCR에서는 primer가 확실히 희망하는 DNA site에 합격할 수 있도록 충분한 온도가 된 후에 PCR이 진행되고 필요한 물질(ex.polymerase, MgCl2, dNTP)을 넣어 준다. 그러면 primer가 불초치하는 DNA 분자와 달라붙는 상황을 피할 수 있어 상대적으로 명확한 결과를 얻을 수 있다.

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7)RAPD PCR

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RAPD(randomamplified polymorphic DNA) PCR은 두 생명체가 계통 유전학적으로 얼마나 비슷한지 알아낼 때 사용한다. PCR을 진행할 때 primer가 짧을 경우 게놈상의 여러 곳에 달라붙어 여러 조각(fragment)을 발생시키고 전기영동을 사용하면 생명체마다 독특한 band를 형성하게 되는데 이를 통해 생명체 간의 거의 유사성을 판별할 수 있다. 만약 두 사람의 생명체가 평등한 종 1경우에는 band형태가 유사한 것으로, 그렇지 않은 경우에는 서로 많은 차이가 나타납니다. 이 RAPD PCR은 비법이 비교적 간단하고 용이하며, genomesequencing을 실시하기 전에 대략적인 종간의 관계를 확인하기 위해 사용된다. 8) Real time q PCR(quantitative PCR) PCR 산물의 양을 실시간으로 측정하는데 사용되는 기술입니다. DNA, RNA, cDNA의 양을 정량적으로 분석할 수 있으며 하나의 샘플로 PCR 산물의 copy 수를 측정할 수 있다. RT-qPCR 비법에서는 형광염색법(dye)을 사용하지만, SYBR-green, Evagreen 혹은 DNA probe를 갖는 형광, Taqman을 이용해 실시간으로 증폭되는 산물의 양을 정량적으로 측정한다. 9)Nest PCR Nest PCR은 한번 PCR에서 증폭된 DNA단편을 다시 내부의 primer를 사용하여 증폭하는 요령입니다. 두개의 다른 primer set을 이용하고 연속적으로 두번의 PCR을 진행하게 되면 비특이적 반응을 감소시킬 수 있어 정확하고, PCR을 2회 실시하므로 감이 상승하는 효과를 얻을 수 있다.

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하나 0)Multiplex PCR

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한 번의 PCR로 다른 여러 DNA를 증폭시키는 분자생물학적 기술입니다. 반응하는 용액에 다른 DNA를 증폭시키는 primer를 처음 첨가하여 target sequence에 부착되도록 PCR 조건을 충족하면 한번에 증폭되어 상당한 시간과 노력을 절약할 수 있다. 하지만 나쁘지 않게 한번에 다양한 target을 증폭시키기 위해 각 primerset의 annealing 온도를 유사한 범위에서 최적화해야 하는 전처리 작업이 필요하다. Multiplex PCR은 병원균 확인, SNP genotyping, 갑작스러운 변화 분석, template의 양, RNA를 detection 하는데 유용하다. 11)Inverse PCR Inverse PCR은 기이 서열을 알고 있는 DNA양쪽으로 서열을 모르는 부분을 알고자 할 때 많이 이용된다. 예를 들어 5'-xxxxxxx=========xxxxxx-3'(x서열을 모르고=서열을 알고 있는 소리) 이러한 염기 서열에서 x부분을 알려고 할 때 사용되지만 제일 제일 먼저 제한 효소로 자르고 자른 부위를 바탕으로 만든다. 그리고 그 원이 된 곳에 primer를 붙이는데, 이때 연장(elongation)과 같은 방향으로 가도록 primer를 붙인다. Inverse라는 스토리는 primer가 기존의 PCR와는 다른 방향으로 간다고 해서 붙여졌다.

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이외에도 더 많은 PCR이 산업, 의학, 과학, 농업 등 다양한 분야에서 사용되고 있으며, 보다 효율적인 PCR 기술이 현재도 개발되고 있다. PCR는 분자생물학의 실험법으로 특정 유전자를 증폭시켜 유전형을 알아내는 것에서 신종 인플루엔자, HIV, 지카바이러스, 콜레라균 등 모든 병원균을 검출해 종류를 확인할 때, 변사체의 신원을 분석할 때, 네안데르가면 사람의 뼈에서 추출한 DNA에서 현생인류와의 연관성을 찾을 때 등 매우 다양한 분야에서 적용되고 있다. 전 세계 PCR시장의 규모와 PCR기반 기술에서 작동하는 차세대 염기의 시장이 200억달러 이상의 규모가 된다는 예측처럼 PCR은 현대 문명을 구성하는 하 쟈싱의 핵심 기술임.

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